融合蛋白在分子生物學中的應用極為廣泛，最簡單的應用是在蛋白質的末端連上標簽，用于WB檢測或純化。復雜一些的應用則是將需要研究的目的蛋白與另一個標記蛋白連接：當標記蛋白為熒光蛋白時，可將目的蛋白的示蹤和圖像學分析；標記蛋白為白蛋白或者抗體Fc片段時，可用于延長目的蛋白的半衰期；又或者將兩個目的蛋白連接，用于研究他們的共同功能或者相互作用。

作為需要使用融合蛋白的科研工作者，了解一些必要的Linker知識，將使得您在設計質粒方面更加得心應手。本文將介紹一下天然形式下的蛋白Linker和目前應用最廣泛的人工合成Linker，以及他們的特性；其次介紹通過增加蛋白Linker實現的各種功能，包括提高折疊和穩定性，促進蛋白質表達，增加內在生物學活性；最后介紹如何使用在線工具設計Linker。

我們通常將使用的蛋白Linker分為3種，分別為柔性Linker、剛性Linker以及可剪切（或自剪切）Linker。

  

柔性Linker

最常見的柔性Linker就是G（Gly）甘氨酸和S（Ser）絲氨酸的GS組合，最常用的GS組合就是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，通過改變n的大小，研究者可以將結構域之間的距離放大和減小，實現結構域分離（n≥2）或連接結構域，研究其相互作用。

其他一些常見的蛋白Linker具有一些特定的用途，例如單鏈可變片段（single chain variable fragment (scFv)）中，連接重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）的柔性Linker，通常為KESGSVSSEQLAQFRSLD和 EGKSSGSGSESKST。這些序列中甘氨酸（Gly）和絲氨酸（Ser）提供柔軟度，谷氨酸（Glu）和賴氨酸（Lys）提高水溶性。

更簡單粗暴一些的柔性Linker就是純甘氨酸（Gly）組成的(Gly)8，或短一點點的(Gly)6，它們的優點是在酵母表達純化過程中，能夠抵抗蛋白酶的水解，同時保護兩端蛋白結構域的功能活性。

 

剛性Linker

具有(EAAAK)n序列的α-螺旋形成的Linker具有內部氫鍵和密切聯系肽鏈骨干，剛性且穩定。因此，剛性α-螺旋Linker可作為蛋白質結構域之間的剛性間隔。通過將藍色熒光蛋白（EBFP）和綠色熒光蛋白（EGFP）連接在一起，評估熒光共振能量轉移（FRET）之間的效率，可以發現(EAAAK)n序列連接兩個熒光蛋白時，熒光共振能量轉移效率比(GGGGS)n序列低，說明α-螺旋Linker能夠有效的隔離兩個不同的蛋白結構域。

另一種類型的剛性Linker具有Pro-rich序列(XP)n，其中X可指定任何氨基酸，推薦選擇丙氨酸（Ala），賴氨酸（Lys）或谷氨酸（Glu）。(XP)n序列沒有螺旋結構，Linker中存在的脯氨酸（Pro）可以增加骨架硬度，并且有效分離結構域。富含脯氨酸序列的結構在機體中廣泛的存在，例如骨骼肌蛋白的N端就存在(Ala-Pro)7的結構。

剛性Linker表現出相對堅硬的結構，能夠有效的將兩端的蛋白結構域分開，通過改變n的大小，就能夠輕易調整結構域之間的最佳距離，從而保證兩端蛋白的活性與生物功能。

 

可剪切Linker

到目前為止討論的Linker通常不會在體內裂解。這些穩定的接頭共價連接兩個功能域，使得融合蛋白在體內變成一個蛋白。功能結構域之間的穩定連接提供許多優點，例如延長的血漿半衰期（例如白蛋白或Fc融合）。然而，它也有一些潛在的缺點，包括功能域之間的空間位阻，生物活性降低，以及由于域之間的干擾導致蛋白質部分的生物分布和代謝方式改變。在這些情況下，引入可剪切Linker，使得融合蛋白能夠在體內釋放，分離兩個功能結構域。

一個研究的比較透徹的過程是二硫鍵的還原。這個可剪切Linker序列為LEAGCKNFFPR↓SFTSCGSLE，基于二硫環肽，在接頭上的兩個半胱氨酸（Cys）殘基之間形成的分子內二硫鍵，同時這個序列對凝血酶敏感。在凝血酶的作用下能夠有效的對Linker中凝血酶敏感序列（PRS）進行切割。

其他比較流行的可剪切Linker，能夠不依賴蛋白酶，自行進行切割處理，使得兩個結構域斷裂。這些自剪切Linker通為2A短肽，通常在序列NPG↓P進行自剪切分離。2A短肽通常來源于病毒的蛋白質序列，例如P2A表示來源于豬捷申病毒（porcine teschovirus-1）；E2A表示來源于馬鼻炎病毒（equine rhinitis A virus）；F2A表示來源于口蹄疫病毒（Footand Mouth Disease Virus）。由于自剪切效率各有不同，2A短肽之間也存在一定差異，我們一般推薦使用P2A或T2A序列。

如何設計Linker

隨著對天然多結構域蛋白中的Linker和重組融合蛋白的廣泛研究，研究者們萌生了構建數據庫的想法，提出了Linker設計工具，基于融合蛋白的期望特性來合理設計Linker。這種類型的工具的一個典型例子是名為synlinker的程序，該程序在用戶指定的輸入（例如Linker長度，要避免的蛋白酶敏感序列）中搜索其連接子序列的數據庫，并生成幾個連接子序列的輸出。Linker數據庫是基于這樣的假設建立的，即在X射線晶體結構或NMR溶液結構中觀察到的環序列可能采用延伸構象作為融合蛋白中的Linker。最終的數據庫包含14,734個序列，它們包含PDB文件中的記錄，可自動識別蛋白質的二級和環狀結構。程序的基本輸入是Linker序列的期望長度，通常表示為殘基數量或以埃為單位的距離。額外的輸入參數包括，避免被蛋白酶或限制性內切酶切割，使得選擇的Linker在克隆過程中對特定蛋白酶穩定或序列對限制性內切酶具有抗性。使用者還可以加入氨基酸組成偏好（例如，消除疏水性殘基）以進一步選擇其感興趣的Linker。此程序可以作為生成Linker序列的工具，使用十分便利（http://synlinker.syncti.org/）。

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參考文獻

[1] Fusion proteinlinkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct;65(10):1357-69. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.039. Epub 2012 Sep 29.

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[3] High cleavageefficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human celllines, zebrafish and mice. PLoS One. 2011; 6(4):e18556. doi:10.1371/journal.pone.0018556. Epub 2011 Apr 29.